Analiza aerului expirat de la pacienţii trataţi cu radioterapie anti-tumorală

Introducere
Scopul acestei faze este de a măsura precis concentraţia de etilenă din aerul exalat al pacienţilor bolnavi de cancer şi trataţi cu radioterapie anti-tumorală. Această monitorizare permite determinarea influenţei radiaţiilor X în declanşarea stresului oxidativ asupra pacienţilor iradiaţi.
Stresul oxidativ descrie presiunea continuă exercitată de radiaţiile ionizante, care prin iniţierea unor reacţii de oxidare, agresează membranele şi organitele celulare. În urma stresului oxidativ are loc o deteriorare a pereţilor celulari, cu o perturbare a metabolismului tisular, a potenţialului de membrană şi a activităţii enzimatice. De asemenea, s-a demonstrat că stresul oxidativ poate determina mutaţii genetice şi degradări ale substanţelor cu viaţă lungă (colagen, elastină). Astfel, ca o consecinţă a tuturor acestor efecte, în timp se pot manifesta fenomenele de uzură şi de degenerare, cu apariţia unor tulburări grave.
Radicalii liberi sunt cei mai cunoscuţi compuşi care întreţin stresul oxidativ. Organismul nostru produce radicali liberi în mod natural (radicali liberi endogeni), atunci când respirăm, digerăm alimente, neutralizăm băuturile alcoolice şi medicamentele sau când celulele transformă grăsimile şi carbohidraţii în energie. Pe lângă substanţele endogene responsabile cu declanşarea şi întreţinerea stresului oxidativ, organismul este asaltat în mod continuu de compuşi exogeni (care provin din mediul extern). Substanţele exogene care exercită o acţiune agresivă asupra membranelor şi organitelor celulare, iniţiind sau întreţinând stresul oxidativ, provin din: gaze şi gudroane, substanţe străine sau sintetice din alimente sau medicamente, toxine, metale grele, radiaţii (ionizante, UV) etc. 
Stresul oxidativ nu este o afecţiune, un simptom sau un sindrom, ci este un proces biochimic şi fiziologic, la care, ca şi în cazul stresului psihologic, răspunsul este adesea inadecvat. Dacă nu ar exista stres oxidativ endogen, activitatea musculară şi metabolismul energetic s-ar diminua până la dispariţie, ceea ce nu este compatibil cu viaţa (sinteza de ATP ar fi stopată). Dar pe lângă stresul oxidativ generat şi întreţinut de organismul nostru, suntem asaltaţi în continuu, în condiţiile vieţii moderne, de numeroşi radicali liberi care ajung în corp din mediu extern. În aceste condiţii, mecanismele interne antioxidante sunt adesea depăşite, producându-se în timp perturbări grave [1-6]. 
Etilena apare în aerul expirat, în urma stresului oxidativ. Este, de fapt, o consecinţă a stresului oxidativ la nivel celular din cauza radicalilor liberi formaţi în exces.
Pereţii membranari fini ai vaselor de sânge din plămâni (cu o grosime de aproximativ 0,5-0,6 µm,) realizează schimbul de gaze, astfel încât, este destul de uşor pentru unele gaze (cum ar fi etilena ), care sunt transportate de sânge la plămâni, să fie eliminate odată cu aerul expirat. Principiul testului de respiraţie se reduce la următoarele etape: producerea de molecule marker în celule şi organe, difuzia în ţesuturi, intrarea în fluxul hematiilor, transportul către plămâni, eliberarea în aerul expirat, colectarea aerului şi detecţia markerului în aerul exalat. În consecinţă, producerea de etilenă poate furniza indicaţii asupra stării de sănătate a corpului uman. Tehnica spectroscopiei fotoacustice cu laser asigură o metodă neinvazivă pentru monitorizarea în vivo a funcţionării celulelor umane şi este deosebit de utilă pentru diagnosticarea medicală.
Montajul experimental
Detecţia urmelor de etilenă în respiraţia umană s-a realizat prin metoda spectroscopiei fotoacustice cu laser. Această tehnică este suficient de sensibilă pentru monitorizarea directă a etilenei din aerul exalat[7, 8].
Principiul de detecţie fotocustică, în gaze moleculare, poate fi împărţit în următoarele etape: modulaţia radiaţiei laser, cu lungimea de undă suprapusă peste o linie de absorbţie a moleculei ţintă; excitarea moleculelor ţintă prin absorbţia radiaţiei incidente, care este stocată ca energie de vibraţie-rotaţie; dezactivarea moleculelor excitate prin ciocniri, prin care energia radiaţiei absorbite este transformată în energie termică, manifestată printr-o încălzire tranzitorie locală; extinderea şi contracţia gazului într-un volum închis, dă naştere la variaţii de presiune (unde acustice); monitorizarea undelor acustice rezultate, cu un microfon [9-12].
Aparatura experimentală este bazată pe un laser cu CO2 cu următoarele caracteristici: emite în domeniul spectral IR, este stabilizat în curent, puterea maximă 6 W. 
Laserul cu CO2 este acordat pe linia de emisie 10P(14) la 10,532 μm unde apare cea mai puternică absorbţie a etilenei. Chopper-ul lucrează la frecvenţa de 564 Hz modulând radiaţia continuă provenită de la sursa laser. Pulsurile laser generate sunt focalizate de o lentilă în interiorul tubului rezonator al celulei fotoacustice [13,14].
 Celula este echipată cu patru microfoane sensibile (model EK 3033, Knowles Electronics) cu sensibilitatea de 20 mV/Pa fiecare, fixate într-un cilindru de teflon. Microfoanele sunt conectate în tubul rezonator prin intermediul unor canale, care împreună cu volumele în care sunt plasate microfoanele, reprezintă un rezonator Helmholtz.
Semnalul electric generat de microfoane este trimis spre un amplificator lock-in sincronizat cu chopper-ul. Semnalul fotoacustic înregistrat de microfoane este proporţional cu concentraţia de etilenă.
Amplificatoarele lock-in sunt folosite pentru detecţia şi măsurarea semnalelor acustice foarte mici – de ordinul nV. Măsurări precise pot fi făcute atunci când se impune extragerea de sub zgomot a unui semnal de amplitudini foarte mici.	

Fig.1 Schema generală a instalaţiei de spectroscopie fotoacustică
Pentru înregistrarea şi prelucrarea datelor obţinute în montajul experimental fotoacustic, semnalele de la ieşirile amplificatorului lock-in şi radiometrului sunt achiziţionate, în timp real, cu ajutorul unei interfeţe specializate (placa de achiziţie AD – DA tip KPCI 3102, produsă de firma Keithley), controlată de un program dezvoltat sub software-ul Test Point specific, ce deserveşte placa de achiziţie.  
Programul este conceput să ruleze, fără limite de timp, pe toată durata efectuării măsurătorilor fotoacustice, acesta asigurând în interfaţa grafică configurabilă de utilizator atât reprezentarea funcţie de timp a concentraţiei gazului şi a puterii laser, cât şi medierea acestor parametri din lotul de eşantioane achiziţionat (300-1000 de achiziţii periodice) [15]. 
De exemplu, în cazul etilenei, se vor utiliza pentru determinarea concentraţiei, linia 10P(14), caracterizată de un coeficient de absorbţie al etilenei de 30,4 atm-1cm-1 .
Eşantioanele de aer exalat de la pacienţii testaţi au fost colectate în pungi aluminizate cu volumul de 750 ml prevăzute cu o supapă care etanşează punga după umplerea ei şi cu un robinet care permite conectarea pungii la sistemul de control al gazului. Eşantionul de aer exalat este transferat în celula fotoacustica de măsură şi analizat în flux continuu cu aer sintetic, fluxul de aer fiind reglat de un debitmetru electronic de curgere masică (model UR-4100 by Techno Fittings) [7]. 
Concentraţia de etilenă din aerul exalat de pacienţi în timpul tratamentului cu radiaţii X
Radiaţiile ionizante distrug structurile cromozomice responsabile de diviziunea celulară,  antrenând moartea celulelor canceroase. Celulele sănătoase sunt atacate şi ele, dar au o capacitate de restaurare mai mare.
Pentru a demonstra această afirmaţie am analizat etilena din aerul expirat al pacienţilor cu cancer de la Spitalul Clinic Coltea (cancer mamar, cancer col uterin cu metastaze osoase, cancer ovarian). Probele de aer exalat au fost luate înainte şi după ce pacienţii au făcut radioterapie externă (radiaţii X) cu administrarea unei doze de 2-8 Gy/zi în funcţie de cancerul tratat. După ce probele de aer exalat au fost colectate în pungi aluminizate, aerul este transferat în celula fotoacustica de măsură şi analizat.
Analiza concentraţiilor de etilenă din pungi se face după ce celula fotoacustică a fost vidată şi curăţată cu flux de N2 la presiune atmosferică timp de 10-20 minute: Pmas = 2 W; S = 0,037  mV .
Fig. 2 prezintă concentraţia de etilenă  pentru un subiect sănătos şi trei pacienţi  cu cancer mamar trataţi prin raze X, cu o doză de 8 Gy. Nivelul de etilenă pentru primul pacient înainte şi după terapia cu raze X arată o creştere de la ~ 0,0018 ppm (părţi per milion) la  ~ 0,023 ppm, pentru al doilea pacient concentraţia de etilenă înainte de terapie a fost de ~ 0,021 ppm şi după ~ 0,03 ppm, pentru al treilea pacient concentraţia fiind de ~ 0,017 ppm înainte de terapie şi 0,023 ~ ppm după terapie, în timp ce pentru un subiect sănătos nivelul de etilenă este de  ~ 0,006 ppm [16]. 
După tratamentul anti-tumoral (radiaţii X) se observă ca are loc o creştere a concentraţiei de etilenă în aerul expirat, arătând că au fost iniţiate reacţii de oxidare asupra membranele şi organitele celulare iar acest proces poate fi detectat cu ajutorul spectroscopiei fotoacustice în primul minut după iradiere.

Fig. 2. Concentraţia de etilenă pentru un subiect sănătos şi trei pacienţi trataţi prin radioterapie anti-tumorală
Interacţia razelor X cu organismul uman modifică statusul stresului oxidativ printr-o creştere a proceselor de peroxidare iniţiate de radicalii liberi ai apei care au fost generaţi de efectul indirect al radiaţiilor în ţesuturile vii. O parte consistentă a proceselor de peroxidare produce etilenă prin peroxidare lipidică. Fracţiunea produsă de etilenă prezentă în aerul exalat ne dezvăluie scara leziunilor tisulare în organismul uman după fiecare sesiune de tratament cu radiaţii X.
Concluzii
Obiectivul principal al acestei etape a fost de a monitoriza concentraţiile de etilenă la pacienții trataţi cu radiaţii X cu ajutorul metodei de spectroscopie laser fotoacustică. Fără îndoială, această aplicaţie reprezintă una dintre cele mai noi şi interesante direcţii de cercetare, în care detecţia fotoacustică dovedeşte rezultate promiţătoare. Investigaţiile prezentate aici reprezintă testele preliminare efectuate în acest domeniu, urmând ca în continuare aceste studii să se extindă în sfera cercetării medicale, având la bază colaborarea eficientă cu personalul de specialitate.
Spectroscopia laser fotoacustică a demonstrat posibilitatea monitorizării concentraţiei de etilenă din aerul expirat la om în timp real şi foarte rapid, fiind un bun montaj de detecţie a etilenei din aerul expirat datorită peroxidarii lipidice indusă de radiaţia X. Avantajele oferite de această metodă sunt: sensibilitate ridicată în detecţie; timp de răspuns foarte scurt; domeniu dinamic larg pentru măsurarea unor concentraţii extrem de reduse.

Bibliografie
[1].	M. R. McCurdy, Y. Barkhirkin, G. Wysocki, R. Lewicki, F. K. Tittel, J. Breath Res. 1, 014001 (2007).
[2].	C. S. Patterson, L. C. McMillian, K. Stevenson, K. Radhakrishnan, P. G. Shiels, M. J. Padgett, J. Breath Res. 1, 026005 (2007).
[3].	W. Cao, Y. Duan, Clinical Chemistry 52, 800 (2006).
[4].	G. J. Handelman, Blood Purif. 21, 46 (2003).
[5].	K. S. Stevenson, K. Radhakrishnan, C. S. Patterson, L. C. McMillan, K. D. Skeldon, L. Buist, M. J. Padgett, P. G. Shiels , Journal of Breath Research 2, 8 pp (2008).
[6].	O. Dale, H. Bergum, T. Lund, T. Nilsen, P. Aadahl, R. Stenseth, Free Radical Research, 37, 815 (2003).
[7].	QuinTron Instrument Company, Inc. QT02444 Rev. C –Catalog/Info Booklet.
[8].	D. C. Dumitraş, D. C. Dutu, C. Matei, R. Cernat, S. Baniţă,  M. Pătăchia, A. M. Bratu, M. Petrus, C. Popa,  Laser Physics 21, 796 (2011).
[9].	C. Popa, R. Cernat, D. C. A. Dutu, D. C. Dumitraş, U. P. B. Sci. Bull. A 73, 167 (2011).
[10].	D.C. Dumitraş, D.C. Dutu, C. Matei, A. Măgureanu, M. Petrus, C. Popa, J. Optoel. Adv. Mat. 9, 3655 (2007).
[11].	R.Cernat, C. Matei, A.M. Bratu, C. Popa, D.C.A. Dutu, M. Pătăchia, M. Petrus, S. Bănita, D.C. Dumitraş, Rom. Rep. Phys 62, 610 (2010).
[12].	M. Bratu, C. Popa, C. Matei, S. Bănita, D. C. A. Dutu, and D. C. Dumitraş, J. Optoel. Adv. Mat. 13, 1045 (2011).
[13].	C. Popa, A. M. Bratu, C. Matei, R. Cernat, A. Popescu and D. C. Dumitraş, Laser Physics 21, 1336 (2011).
[14].	C. Popa, D. C. A. Dutu, R. Cernat, C. Matei, A. M. Bratu, S. Bănita, and D. C. Dumitraş, Appl. Phys. B 103, DOI: 10.1007/s00340-011-4716-8 (2011).
[15].	D.C. Dumitraş, S. Bănita, A.M. Bratu, R. Cernat, D.C.A. Dutu, C. Matei, M. Pătăchia, M. Petrus, C. Popa, Infrared Phys. Technol. 53, 308 (2010).
[16].	C. Popa, C. Matei, Optoelectronics and Advanced Materials- Rapid Communications 5, 1237 (2011).

                                                                                                                                                                  Director proiect,
                                                                                                                                                                  Ramona CERNAT